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保興生物:大腸桿菌發酵過程中防止包涵體形成之終極解決方案

時間: 2019-11-13來源: 作者:

安徽快三走势图最新行情 www.qltam.com 一、包涵體定義

包涵體是外源基因在原核細胞中表達時,尤其在大腸桿菌中高效表達時,形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質顆粒,在顯微鏡下觀察時為高折射區,與胞質中其他成分有明顯區別。它們致密地集聚在細胞內,或被膜包裹或形成無膜裸露結構,這種水不溶性的結構稱為包涵體(Inclusion Bodies,IB)

一般含有50%以上的重組蛋白,其余為核糖體元件、RNA聚合酶、內毒素、外膜蛋白ompC、ompFompA等,環狀或缺口的質粒DNA,以及脂體、脂多糖等,大小為0.5-1μm,具有很高的密度(約1.3mg/mL),無定形,呈非水溶性,只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。包涵體形成是比較復雜的,與胞質內蛋白質生成速率有關,新生成的多肽濃度較高,無充足的時間進行折疊,從而形成非結晶、無定形的蛋白質的聚集體;此外,包涵體的形成還被認為與宿主菌的培養條件,如培養基成分、溫度、pH值、離子強度等因素有關。細胞中的生物學活性蛋白質常以可融性或分子復合物的形式存在,功能性的蛋白質總是折疊成特定的三維結構型。包涵體內的蛋白是非折疊狀態的聚集體,不具有生物學活性。


二、包涵體對于發酵制品的影響

包涵體具有富集目標蛋白質、抗蛋白酶、對宿主毒性小等優點。包涵體的形成對于重組蛋白的生產也提供了幾個優勢:

包涵體具有高密度,易于分離純化;

組蛋白以包涵體的形式存在時可有效地抵御大腸桿菌中的蛋白酶對目的蛋白的降解;

對于生產那些處于天然構象時對宿主細胞有毒害的蛋白時,包涵體的形成無疑是最佳選擇。

但是這些包涵體形式表達的蛋白通常是錯誤折疊的,因此不具備生物學活性,這將不利于發酵制品的應用,同時也不利于蛋白的結構分析以及蛋白組學的研究,所以大多數情況下都需要將不溶性的蛋白包涵體轉化為可溶性的蛋白。

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三、包涵體的形成機理

(1)表達量過高研究發現在低表達時很少形成包涵體,表達量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成的速率過快,以至于沒有足夠的時間進行折疊,二硫鍵錯誤配對,過多蛋白間的非特異性結合,蛋白質無法達到足夠的溶解度等。動力學模型表明:活性蛋白的產率取決于蛋白合成的速率、蛋白折疊的速率、蛋白聚集的速率(如圖1所示)。在高水平表達時,新生肽鏈的聚集速率一旦超過蛋白正確折疊的速率就會導致包涵體的形成。